显微镜下的流感病毒- A型流感病毒的组装保真度及其对宿主细胞逃逸的影响

甲型流感病毒(IAV)是一种负意义的单链节段RNA病毒。人工流产是哺乳动物(包括人类和鸟类)流感或“流感”的罪魁祸首。甲型流感病毒株会在人类中引起季节性流感流行，偶尔的大流行会导致更高的死亡率，特别是西班牙流感和亚洲流感大流行。流感病毒还对世界范围内的牲畜产生经济影响，例如禽流感(鸡)。甲型流感病毒是根据两种主要的包膜抗原血凝素[HA]和神经氨酸酶[NA]分类的，例如H1N1。

• 血凝素(HA)在病毒与宿主细胞受体的附着(结合)过程中起关键作用。HA与细胞膜糖蛋白的唾液酸残基结合。然后病毒通过内吞作用被吞噬并进入细胞的内体运输系统。
• 神经氨酸酶(NA)在病毒从被感染的宿主细胞中释放时起作用。NA是一种病毒神经氨酸酶，其作用是从宿主细胞的糖蛋白中切割唾液酸残基，使病毒子代从细胞分离并继续感染其他细胞。

因此，HA和NA具有对抗唾液酸的竞争活性，这是与细胞结合和从细胞中逸出所必需的。这些活性的功能平衡对于细胞的有效感染至关重要——使神经氨酸酶抑制剂成为抗病毒治疗的主要兴趣。尽管在感染周期中需要这种微妙的平衡，但病毒的遗传和形态变异对它们的生存和进化起着重要的作用。高突变率使得IAV等病毒能够避开免疫系统和抗病毒药物。事实上，目前神经氨酸酶抑制剂治疗人类IAV的有效性是有限的。

利用荧光显微镜研究IAV的HA和NA表型和适应度

电子显微镜和质谱法是研究病毒大小、结构和组成的有用技术，但它们不考虑重要的变异，实际上也不考虑复制适应性所必须的保守性。然而，荧光显微镜技术允许对单个细胞随时间的变化进行研究。因此，这是病毒学研究的兴趣所在，但具有挑战性。像IAV这样的病毒在80-120nm的区域内很小，与它们感染的宿主细胞相比显得矮小。因此，很难在不影响病毒功能的情况下标记病毒成分。此外，只有少量的标签使信号微弱，低于光的衍射极限。通过使用有效的标记策略和成像方法，如共聚焦或TIRF(全内反射荧光)，或超分辨率显微镜技术，在高灵敏度EMCCD摄像机的辅助下，可以克服这些挑战，并进一步深入了解病毒学中一些更复杂的问题。

Vahey和Fletcher最近在《细胞》杂志上报道了“甲型流感病毒的低保真组装促进从宿主细胞逃逸”，如何在iav群体中研究单个病毒粒子，使用共聚焦和TIRF显微镜将其表型变异性与其复制适应性联系起来。

IAV标记株设计

本研究的一个重要方面是在功能扰动最小的情况下设计和使用多种病毒蛋白的标签。以前的研究使用的报告系统大小为~25kDa。在本研究中，标签很小，大约5-10个氨基酸大小，荧光团小，标签约为1kD。这就不太可能影响病毒粒子的功能。结合酶、探针和FIAsH膜透性染料，使用位点特异性标记。获救的变种有多达4个标签，使研究IAV病毒粒子的种群以及关键的包膜抗原如何影响感染成为可能在活的有机体内．

表型变异对病毒从宿主细胞逃逸的影响

通过使用标记技术以及研究中描述的共聚焦和TIRF成像技术，Vahey和Fletcher能够进行以下观察:

• A型流感病毒形成的后代在大小、形状和HA/NA组成方面都有一定范围
• 他们发现病毒粒子的异质性不仅仅是由于遗传变化，它发生在组装过程中，并受到细胞内局部环境的影响。
• 单个病毒粒子产生的子代存在变异，在更广泛的人群中也存在变异。

Vahey和Fletcher报告的关键发现是HA/NA组成的表型变异决定了病毒的释放，并允许在神经氨酸酶抑制剂的响应下从宿主细胞逃逸。通过添加神经氨酸酶抑制剂，具有较高NA成分的病毒粒子能够逃逸并继续进行下一个感染周期。HA和NA -在组装水平上的化学计量分布的广泛差异赋予了IAV在不断变化的环境中生存的能力，如宿主免疫反应或抗病毒神经氨酸酶抑制剂的存在。进一步的工作将有助于进一步扩大我们对HA和NA在IAV传染性中的理解，并可能导致新的抗病毒治疗方法。除此之外，观察表型多样性在其他地方对IAV和其他病毒所起的作用将是有趣的。

显微镜设置

对于共聚焦成像，Vahey和Fletcher使用尼康Eclipse Ti显微镜和共聚焦旋转盘，配备了一个Andor Zyla sCMOS相机， 60X和100X APO TIRF物镜(1.49 NA)，以及安多ILE激光合成器．为了TIRF成像，他们把sCMOS相机换成了一台安多iXon超EMCCD相机获得校准标记病毒表面分子计数所需的更高灵敏度。iXon EMCCD相机提供了比sCMOS相机更高的灵敏度，使其能够在单分子水平上处理小报告蛋白和标签。

研究论文：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418314557

特色实验室:加州大学伯克利分校弗莱彻实验室

伯克利的弗莱彻实验室有一个由首席研究员丹尼尔·弗莱彻领导的多学科团队。本课题组的研究方向为“生物装配的可视化与控制”。因此，病毒和宿主细胞的相互作用只是更广泛研究范围的一个方面。他们开发新的技术，并将其应用于在体外还有活细胞，通过分子水平的过程来帮助连接生物系统。他们的研究涵盖了细胞生物学的许多基本方面，从生物结构到这些知识的应用，例如潜在的治疗策略。

了解更多关于弗莱彻实验室的信息:https://fletchlab.berkeley.edu/

选定的出版物

• 卡曼卡门·陈，阿什利·l·亚瑟，约翰内斯·莫斯坦，金美燕，阿巴拉·巴特，Dörte施莱辛格，孙成民，Donté A.史蒂文斯，大卫·G.德鲁宾，丹尼尔·A.弗莱彻。进化上相关的小病毒融合子劫持独特但模块化的肌动蛋白成核途径，以驱动细胞-细胞融合。bioRxiv 2020.06.03.130740;doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.03.130740
• 陈嘉曼，孙成民，伊娃·M·施密德，丹尼尔·A·弗莱彻。病毒融合原劫持肌动蛋白骨架以驱动细胞-细胞融合。eLife 2020; 9: e51358。https://elifesciences.org/articles/51358
• 迈克尔·D·瓦伊，丹尼尔·A·弗莱彻。A型流感病毒表面蛋白的组织有助于穿透宿主粘液。eLife 2019; 8: e43764。https://doi.org/10.7554/eLife.43764.001