emccd的定量稳定性

图1 -运行中的iXon基线钳(偏置稳定性)。自2002年以来iXons的标准功能。

电磁ccd容易受到各种数据不稳定来源的影响。在iXon Ultra和iXon3中，每个源都得到了解决，以确保在整个动力学采集过程中可靠的定量性能和测量之间的可重复性。

基线夹
基线(或偏置电平)是添加到EMCCD传感器输出信号的电子偏移量，以确保显示的信号电平始终是正数计数。没有实际噪声与这个正计数值相关联，因此认识到它不影响灵敏度是很重要的。但是，在进行信噪比计算时，必须记住从信号强度中减去基线偏移值。

传统上，当获取数据时，探测器头部内驱动电子设备产生的热量的微小变化可能导致基线水平的一些漂移。这通常在长动力学序列中特别容易观察到。

自2002年以来，Andor一直在我们的高端EMCCD相机中解决这一不良影响。

任何在基线水平的漂移可以通过使用我们创新的基线钳选项来纠正。基线钳校正每个单独的图像的任何基线漂移，从每个图像像素减去一个平均偏置信号，然后添加一个固定的值，以确保显示的信号电平总是一个正数的计数。因此，在快速动力学序列中，基线保持在岩石稳定值，如图1所示。

注意:在不同的电磁增益设置下，基线偏置水平也容易发生变化。再一次，iXon基线钳位对此进行了校正，确保无论选择何种EM增益设置，都能钳住偏置电平。

图2 -背光iXon Ultra 897 (512 x 512像素)的EM增益稳定性- LED测量。

电子倍增(EM)和温度稳定性
众所周知，电磁倍增因子与温度有关。这就是为什么iXon开创性的RealGainTM -线性和定量EM增益校准-是温度补偿的原因，即软件EM增益选择与实际EM增益之间的精确相关性在选择的任何冷却温度下都保持不变。稍后将更详细地讨论这一点。

然而，这种温度依赖性的另一个副产品是，我们还必须密切关注优化的温度稳定性调节。iXon Ultra保持+/- 0.01°C的恒温精度。

这种对细节的关注的结果，最好是通过对稳定光源的测量来观察稳定性，如图2所示。

在这里，我们使用背光的iXon Ultra 897来测量来自稳定LED光源的信号，该光源覆盖有分辨率图表，在零环境背景光条件下成像(使用不透光的暗箱)。

动力学系列记录超过500帧@ 55 fps (17.8 ms曝光时间)，帧传输模式，基线钳激活(这样绝对偏置稳定性也到位)。一个中等强度的信号，这样的不稳定性将不会在信号射击噪声中丢失，以x300 EM增益记录。

从数据中得到感兴趣区域动力学图，如图2所示。值得注意的是，在动力学序列的持续时间内，没有观察到额外的相对信号变化。

注意光源不稳定

在进行稳定性测量时，必须注意评估光源的稳定性。例如，将iXon 897安装在研究级宽视场荧光显微镜上，用荧光染料(Invitrogen Molecular Probes)进行免疫染色的固定细胞在类似的动力学序列上成像，如图3所示。

在这些实验中，无论EM增益是开启还是关闭，信号强度的变化都是显著的;其变化幅度远大于信号上的散点噪声。这表明，显微镜本身的光源可以经常受到更大的稳定性变化比可以从任何EM增益不稳定性观察得出。在进行定量时间过程实验时，需要非常仔细地检查所有不良信号波动的来源，例如照明的稳定性(背景照明波动也可能起作用)。