用于检测病毒的病毒生物传感器的研制

最近，随着SARS、中东呼吸综合征和Covid-19等大流行，用于检测病毒病原体的生物传感器引起了人们的极大兴趣。快速识别受污染的食物或水、表面或患者样本中是否存在病毒是有效抗击病毒暴发、流行病以及生物恐怖主义的先决条件。

目前，病毒检测的最高灵敏度是通过依靠聚合酶链反应(PCR)进行病毒DNA和RNA的增殖和检测来实现的。然而，这种技术有一些缺点。它处理时间长(一般24小时)，缺乏实时监测和快速的现场病原体检测，以及这种先进的实验室设备和训练有素的人员是必需的。

人诺如病毒(NoV)检测的生物分析方法

瑞典查尔姆斯理工大学的Fredrik Höök领导的研究小组开发了一种新型的bio-analytical化验用于单病毒敏感性的全病毒颗粒检测。在他们最近的工作中，他们的重点是人类的检测诺瓦克病毒(11月);一种传染性很强的病毒，可引起胃肠炎或更常见的“冬季呕吐虫”。

本研究使用最常见的诺如病毒II.4基因组(Ast/6139/01株)的病毒样颗粒(VLPs)作为病原体模型。诺如病毒是杯状病毒科的一种小型非包膜RNA病毒，具有高度的遗传多样性。它由一个主要由180个保护病毒基因组的衣壳蛋白组装而成的二十面体外壳组成。

“冬季呕吐虫”

这种病毒引起的“冬季呕吐虫”通过大流行在全球传播。尽管它没有像中东呼吸综合征(MERS)或非典(SARS)等其他流行病那样受到关注，但它每年造成20多万人死亡，主要是发展中国家的儿童。诺如病毒是一种非常稳定和极具传染性的病毒，通过口腔-粪便途径传播，经常在食用受污染的食物或水后自发爆发。其监测是最重要的，因为极低的颗粒数量(<100)可能足以引起疾病暴发，因此对其早期检测具有挑战性。

在昆虫细胞中重组表达的自组装衣壳蛋白常被用于探测病毒的结合行为。这些非传染性病毒样蛋白(VLPs)表现出与真实病毒相似的形态和结合特性，并具有高特异性地识别各种唾液和细胞表面糖缀合物，包括膜结合组织血型活性糖syphingolipids (GSL)。在设计用于病毒检测的新型生物传感器原理的工作中，这种VLPs代表了优秀的模型。

图1所示。夹层试验装置示意图。颗粒被捕获到含有10% H型糖鞘脂(GSL)的双分子层上，以高特异性识别VLPs。荧光信号是由含有5% H型1GSL的传感器结合罗丹明标记囊泡的TIRF照明产生的。

本研究中探索的测定方法基于三明治型结构，其中VLPs首先被捕获到含NoV特异性gsl配体的无污染(低非特异性蛋白质吸附)支持的脂质双分子层上。然后通过成像包含相同11 -特异配体的单个荧光标记磷脂囊泡来观察牢固结合的VLPs(图1)。利用TIRF照明产生的消失场来区分表面结合的囊泡与溶液中的囊泡，可以确定和跟踪传感器界面上的囊泡结合和释放事件。因此，这种设置不仅可以可视化单个病毒颗粒，而且还可以获得它们与受体(在这种情况下是GSLs)的亲和性信息。[1]

使用TIRF显微镜结合iXon EMCCD摄像机以每秒5帧的速度拍摄1000帧的延时电影。分析在96孔板中进行，所有感兴趣的孔在7个不同位置成像，以确保统计数据的可重复性。利用matlab软件对图像进行分析。简单地说，如果荧光囊泡的强度超过预先设定的阈值，并且如果它出现在预先定义的连续帧数(至少7帧)上，则对其进行计数。通过记录随着时间的推移新到达的囊泡的数量来生成关联图，并测量囊泡的停留时间。并定量了该方法的检出限。

本研究的结果表明，Höök博士及其同事开发的用于检测诺如病毒的生物传感器表现出良好的特异性，几乎没有非特异性结合(图2)。该方法表现出单分子敏感性，因为可以很容易地看到单个囊泡。这些小泡产生的局部信号可以很容易地从背景噪声中分辨出来。背景噪声可以被有效地抑制，影响检测极限(LOD)的一个关键因素是非特异性结合事件产生的背景信号。需要考虑的一个重要方面是传感界面的无污垢特性，它应该是防病毒和防囊泡的。本研究中使用的脂质双分子层满足这些条件。此外，作者还展示了如何利用囊泡结合事件的实时监测，根据囊泡在底物上的停留时间来区分特异性与非特异性结合，从而进一步降低非特异性背景信号。

图2。在没有VLPs的情况下，用12.5 pM VLPs孵育的双分子层表面结合囊泡的代表性显微镜图像(左图)和阴性对照(右图)。

该研究小组已经证明，一个相对简单的检测装置，结合单分子敏感性和平衡波动分析，可以用于检测LOD为~106粒/ml的病毒颗粒。这种LOD比目前报道的用于检测诺如病毒的生物传感器的LOD更好，此外，整个检测可以在不到两个小时内完成，这比目前最敏感的病毒检测方法(采用PCR)有了显著改进。此外，这些技术可以扩展到其他病毒病原体的研究。

[1] Bally, M.， Gunnarsson, A.;Svensson l;拉尔森，G.日达诺夫;副总裁;Höök, F.，单一病毒样颗粒与含有糖鞘脂的囊泡的相互作用。物理评论通讯，107(18)页188103。

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