显微术学校第7课-免疫组织化学的样品制备

大家好，我的名字是Marco Campinho，我在这里给大家介绍一下免疫组织化学样品制备的概述。样品制备是获得高质量结果的最决定性因素，您可以拥有非常复杂和出色的显微镜设备和硬件，但如果您的样品制备步骤不是最充分的，您将永远得不到您想要获得的高质量结果。为此，每个实验的定制是关键，因为它涉及到大量不同的步骤和大量不同的过程，为了使标签和检测感兴趣的目标。当然，和其他好的实验一样，它是从一个好的实验装置开始的。就像我说的，在开始的时候，我们会关注固定样本的免疫组化。免疫组化考虑了任何免疫组化制备中涉及的八个关键步骤。它从样本收集、固定、预处理、阻断、与您感兴趣的抗体孵育开始，清洗、检测和标本准备成像。

在样本收集中，在你进行的操作中小心和快速是非常重要的。当你解剖动物组织时，这一点尤其重要，因为如果你花太长时间收集组织，你对观察和研究的过程可能会发生变化。同样，你不仅要在解剖动物组织时使用麻醉药，还可以对你想要研究的生物现象产生巨大影响，因为它们会改变动物的生理状况。考虑到这种现象的动态变化会极大地改变你将要达到的结果。同样，使用足够的容器和支架来收集样品也很重要。

所以固定是免疫组化的关键首先要充分选择固定剂。你应该时刻记住两个关键点。首先，抗原的保存以及组织和细胞的完整性。这是因为两种固定条件都可以改变抗原，以及细胞的完整性和形态。最广泛使用的固定剂是交联固定剂。这些是最常见的，甲醛和戊二醛。它们通过相互交联来固定蛋白质。

尽管如此，例如，甲醛会减小组织的大小，而戊二醛会在组织中留下三个活性醛基，这往往会对特定的组织产生非特异性荧光。你也可以使用像乙醇和甲醇这样的凝固剂，它们通过共价键将蛋白质固定在一起它们使蛋白质凝固或沉淀使它们变得坚硬，非常紧密。它们不固定碳水化合物和脂类。它们的优点是不引入荧光，减少洗涤剂的使用，因为它们本身促进了细胞的渗透。

另一种选择是醋酸或苦味酸。它们也沉淀蛋白质，不固定碳水化合物和脂类。作为最后一种选择，你总是可以使用低温保存。它实际上是保存组织、细胞和表位完整性的最佳方法。然而，在固定之前，它们需要用渗透压石缓冲，通常是蔗糖，以防止在细胞内形成冰晶，这会破坏组织和细胞，并促进目标物质泄漏到外部和不应该出现的地方。就像我之前说的，这是一个固定的步骤需要一些处理。根据经验，我总是使用固定剂的体积至少应该是组织质量的10倍，这是因为固定剂对组织的渗透性特别好。如果你有一个大体积的固定剂，这将促进更均匀的固定，将允许你甚至更大的组织被均匀固定，并保持其完整性。

另一方面，你应该始终牢记的是，你应该始终缓冲你的固定剂，因为这将防止任何渗透冲击，可能发生在固定过程中，以及。固定的时间和温度很重要，因为我们正在促进样品中的化学反应或物理化学变化，时间和温度都会影响这些变化。所以，时间和温度之间的良好平衡会让你得到最好的结果。你需要考虑的另一个方面是如果你想通过浸泡来固定，这就是把你的组织放入一个有固定剂的容器中固定剂会渗透到组织中并固定它。或者，例如，如果你想在成年动物(如老鼠或斑马鱼)体内固定器官，你应该考虑灌注。在灌注过程中，你通过固定剂改变血液，固定剂会通过血管进入动物体内，进入组织，使固定非常进出，使固定非常均匀，这在大样本中尤其重要。

固定后，为了去除固定剂，大量清洗是非常重要的。大多数固定剂都是高度反应性的化学物质，如果你不正确地去除它们，它们也会与你接下来要使用的试剂发生反应，尤其是抗体，它也是蛋白质。因为大多数固定剂都以蛋白质为目标，如果你不把它们全部清除，你就有可能破坏这些试剂，得不到你期望的结果。在固定后的洗涤过程中使用洗涤剂也是很好的，因为它们会促进洗涤溶液的更高渗透力，并允许更好地去除里面的所有试剂。

然后在清洗后，长期储存是可能的，这通常是在零下20的甲醇中进行，甲醇是非常好的优点。首先，它将允许从细胞膜上去除一些脂质，促进以后更好地接触化学物质。因为它不会在零下20度结冰，所以你可以将样本保持在非常稳定的条件下，以便以后在更合适的时候使用。然而，执着是理想与实践的结合。理想情况下，良好的固定方法应能保持组织整体的完整性。在实践中，化学固定剂通常是选择性的。例如，像甲醛一样，它会作用于蛋白质的其他醛基。所以，通过这种方式，你应该总是为你感兴趣的分子选择固定剂，或者使用固定剂的组合，或者使用物理固定方法，比如快速冷冻和低温保存。

理想情况下，一个好的固定方法应该保持细胞结构，尽量减少对体积、形态、目标在亚细胞空间中的位置等生活状态的改变。然而，在实践中，组织处理中的固定通常会引起伪影，它们改变了体积，改变了形态。所以要尽量减少这些可避免的问题。这可以通过降低温度或缩短固定时间来实现。但最后，你总是要在固定过程的背景下解释组织结构。

固定后，一些预处理可能是必要的，无论是为了去除会干扰成像的色素，你必须在以后进行。例如，黑色素在显微镜下是非常有害的，因为它会阻止光线进出你的组织，从而在成像过程中掩盖和制造伪影。或者你必须通过不同的预处理来渗透以便让你的试剂，也就是抗体，进入它们的目标。你有不同的方法，比如极性溶剂洗涤洗涤剂或酶处理。在很多情况下，因为不可能使用任何固定技术来保存你想要鉴定的表位，你必须检索它。

渗透预处理，不仅用于洗涤剂，主要有两类洗涤剂，变性洗涤剂，如tween -20或非变性洗涤剂，如TritonX。极性溶剂清洗有时也是必要的，例如，用丙酮处理，以允许去除细胞膜的某些成分，并允许在细胞和组织中创建孔，以便更好地渗透到您的区域，以检测您感兴趣的目标或酶处理。你可以使用胰蛋白酶，它会更有针对性，但你也可以使用定向性较低的酶，比如蛋白酶K，它会吸引每一个蛋白质，但你必须记住，这种使用蛋白酶K的治疗会给你大量的伪影，会破坏你的组织你应该一直小心并非常仔细地监测你的样本。最后，胶原酶也是一个很好的选择，因为大多数动物组织都有富含胶原蛋白的细胞外基质，这是非常不渗透的，用胶原蛋白处理可以非常定向地降解胶原酶，并在样品中引入更高的渗透能力。

表位检索有时也是必要的因为固定的化学方面的方式，它掩盖了表位的三维构象你必须检索它否则你的抗体就不能识别它。为此，你可以使用化学方法，如酸、酮或尿素，或者使用非常广泛的热诱导方法，通过微波辐射样品或将样品浸泡在柠檬酸沸腾溶液中一段时间。当然，任何这些类型的热感应检索都取决于你为它们花费的时间。太少可能对你的表位没有任何影响，太多也可能导致对你的表位的不同确认，这也变得不可能被检测到。所以我们必须找到这种治疗的最佳时间点以便获得最好的结果。

尽管如此，我还是想对预处理做一些重要的说明，它们总是会改变生物学结果，因为它们通常是对组织非常苛刻的处理，它们也可以诱导非特异性背景信号。所以这应该是免疫组织化学准备的一个方面，实验，小心地改变条件，仔细观察你的组织或细胞应该一直在你的脑海里。

在此之后，我们通常会进行阻塞。在阻断过程中，我们的目标是减少抗体与靶蛋白以外的组织蛋白的非特异性相互作用。抗体是一种非常大的多肽它们有大量的表面可以通过静电相互作用相互作用与样本中大量不同的蛋白质不是特异性的。我们想通过阻塞来达到的目的是尽可能减少这些相互作用。常见的阻断是牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，牛奶，动物血清，或者你也可以使用抗体饱和，在这种情况下，你要做的是你使用高度浓缩的抗体溶液你预先培养一个不用于你分析的组织为了让非特异性相互作用的抗体附着在那个组织上。这在多克隆血清中尤其重要，因为它们具有更高的抗体多样性，能够检测您感兴趣的目标，并且可能具有不像您希望的那样特异性的抗体种类。

阻断后，体内就有了抗体。为此，我们依靠抗体的选择性，它们的能力给我们所需的分辨率，在一个巨大的异质样本中精确定位单个分子。还有在一个样本中标记多个目标的能力，如果你想看到互动和对话，这是非常有用的。在这个孵育过程中，你首先使用一抗这个一抗是用来检测样本中的目标并与之相互作用的。这可以是单克隆的，这意味着它们只是一种抗体，它们只检测相同的表位或多克隆，它们通常是在给动物注射抗原后产生的。之后，给动物放血，取出抗体。在这里，你产生了一组抗体，这些抗体有能力在不同的位置结合抗原，从而使你的目标有多个区域是可行的。如果你想瞄准组织中非常稀缺的东西，这是非常有利的，可以增加你检测它的能力。

在使用一抗后，我们将使用二抗来检测一抗。这可以是物种特异性的，这是非常有利的，因为你可能想用小鼠的一种抗体来检测一个目标，而用兔子的抗体来检测第二个目标。然后使用只检测小鼠或兔子的二抗，你可以在同一样本中标记两种一抗，并在同一样本中检测两种目标。同样，如果你不能用不同物种的二抗同时检测两个目标，你实际上仍然有机会使用能够区分不同种类抗体的二抗体。例如，如果你的样本中只有针对你想检测的两个目标的小鼠抗体，当一个是IgG，另一个是IgM时，你可以使用针对小鼠IgG和小鼠IgM的二抗，仍然能够同时检测两个目标。

同样，如果你的一抗没有类别特异性，并且都来自同一类别，但来自不同同型，你也可以使用能够区分不同同型的二抗，例如，igm，你可以从小鼠中检测IgM1和IgM2，并能够使用小鼠的第一抗体特异性地标记两个目标，而不受彼此干扰。同时，你也可以选择与荧光染料或酶结合使用。这将允许你在显微镜中使用一种技术，或另一种技术，它们都有优点和缺点，然后你可以有进一步的选择。

一般来说，当你用抗体进行孵育时，较低的孵育温度倾向于增加特异性因为它们会为抗体创造更严格的条件，这将允许或将有利于抗体特异性地结合到你的目标上或减少与组织或样本中的其他蛋白质的非特异性相互作用。当然，搅拌会使你得到更好的结果，因为它能使溶液和抗体更好地均质化到组织中。你应该时刻记住如果你在幻灯片中做免疫组化，样品的蒸发和干燥，这是你最大的敌人，你应该时刻注意避免这类问题，比如，在孵育期间使用湿室。

清洗后，你用的是非常高浓度的抗体溶液。这意味着即使你取出抗体溶液，它们的抗体也会粘附在其他蛋白质上，而这些蛋白质不是你的目标。所以你必须大量清洗才能去除所有这些。一般来说，我总是使用比我想洗的纸巾质量至少大5倍体积的洗涤液。这也会使非特异性结合的抗体得到更大的稀释这将增强你从样本和组织中释放非特异性结合抗体的能力。室温通常是理想的，因为它增加了溶液的熵，增加了洗涤条件的严格程度。通过增加这些洗涤条件，那些没有紧密结合的抗体就像那些没有结合在目标上的抗体一样会更容易从组织中释放出来这样你就能得到一个更干净的样本。

我总是倾向于洗得太多而不是洗得太少。这是什么意思呢?我更喜欢长时间频繁地洗几次。虽然运行这些程序花费了我更多的时间，但根据我的经验，这表明在实验结束时，背景更少，信号更精确。同样，在洗衣服的时候，使用洗涤剂也是非常可取的。我通常倾向于使用TritonX，这是一种非变性试剂，这样就不会让溶液破坏我的一抗或二抗与目标的特异性结合。或者如果你有比较脏的血清，Tween-20，是一种变性洗涤剂，可以很有效地去除那些顽固的血清。

清洗后进行检测，有两种方法，一种是酶法，即促进显色染料沉积到抗体结合的区域，另一种是荧光法，即使用荧光染料与二抗体结合。在酶的检测过程中，有两种酶通常与二抗结合或者与亲和素和生物素的复合物结合，它们是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。这些酶，通过与亲和素和生物素结合，你可以在它们结合的地方增加酶刺激抗体的数量。正如你在这幅漫画中看到的，在第一步加入一抗，然后加入生物素化的二抗。然后，通过减毒酶复合物加入亲和素再加入酶底物，这样酶促反应就能将酶底物从可溶性变成不可溶性这就在抗体结合的区域形成了不可溶性染色体的沉积物。

这就是你能达到的结果。这里，你可以看到一个检测是蓝色的，另一个检测是棕色的。根据你使用的酶的类型以及你可以使用的染料或底物的类型，你可以有大量不同颜色的组合。它可以是非常多功能的。通常情况下，荧光被更广泛地使用，因为它可以使用不同的显微镜技术，如共聚焦，光片显微镜，它在许多方面更实用，因为它涉及的步骤更少。基本上，你的第一抗体与你的目标蛋白质结合。然后已经与荧光色素结合的二抗与一抗结合一个分子染另一个分子。

荧光也有很多优点。由于存在不同的荧光色素，您可以利用所有的能力，检测样品中的多个目标，通过使用不同的荧光色素。因为有这么多的存在，你有了整个光谱的光，为了有不同的组合，你可以有三个，四个，甚至五个不同的目标标记在同一个标本上。这是非常有利的。正如你在这里看到的，这给了你很大的优势因为你可以在一个组织中以非常高的特异性检测单个细胞，就像你在左边看到的，或者你可以在斑马鱼的整个心脏中非常特异性地检测一个细胞，例如，就像你在右边看到的。

然而，当进行检测时，免疫组织化学程序还没有结束，你仍然需要准备你的标本进行成像，你必须记住三个关键点。你必须逐渐平衡你的样本和嵌入介质，你必须让介质适合你的实验，你必须让不同的介质有不同的特性。所以你必须逐渐平衡你的样本嵌入中位数以保持形态，同时也要有一个非常均匀的样本，当你成像时你不会因为样本的一部分比另一部分透明度低而产生伪影。

同样，你必须让介质适合你的实验因为你可能想要做永久性或非永久性的制备或者因为你要使用显色或荧光标记。这很重要，因为不同的嵌入介质可以与你使用的显色或荧光标记发生反应，可以减少或在你的成像中产生根本不存在的伪影。当然，你要考虑样本是薄的还是厚的。嵌入媒体实际上可以成为你的好盟友，以创造更多或更少的透明度。

同样，你要记住的一件事是你想要使用的介质是你的显微镜设备中可用的物镜和你想要使用的显微镜是否适合那种介质。因为如果介质不能满足光学特性或物镜的要求，你就会得到低于标准的成像，你就会在图像中引入伪影。正如我之前所说，不同的媒体有不同的特点，它们改变形态，这是一个非常重要的方面，因为这种情况几乎一直都在发生。它们可以有更高或更低的透明度。

这里我给你们看一些我用一些比目鱼做的实验，用绿色的钙标记，那是钙沉积在骨头里或者，例如，在眼睛里，还有肌肉组织标记的免疫组织化学，你们在红色看到的。在甘油中，甘油会大大增加样品的透明度，但并没有我们想要的那么多，尤其是在这些1毫米厚的厚样品中。所以我们开始尝试其他的试剂，比如标度A，我们发现标度A，随着时间的推移，大大增加了样品的透明度。但是在这些培养基中的培养时间是6天，例如，你可以开始看到动物形态的巨大变化。不需要的人工制品。三天比六天效果更好。然而，你也注意到，虽然肌肉标记的免疫组织化学因规模化培养时间而增强，但钙的信号却大大减少，正如你在眼睛和头骨中看到的那样。钙信号，随着时间的推移会显著减少。

我还想谈谈一些新兴的技术，这些技术现在正在取得成果，用于免疫组织化学成像和样品制备。这些新兴技术之一是膨胀显微镜。膨胀显微镜有四个基本步骤。染色，染色后，你把标本和凝胶基质连接起来，然后经过消化过程，它被分解，然后膨胀。这是非常有用的，因为它可以让你用更传统的显微镜技术来成像小的结构，让研究人员能够识别小的结构，如果它们没有扩展，那将是很困难的。它使用了一种聚合物系统来做到这一点，它能够将样本量扩大到初始大小的16倍，在某些情况下非常有用。

我认为一个新兴的技术很有前途那就是多功能交联剂的固定。这项技术仍然非常昂贵。但这种固定方法保留了样品的蛋白质构象，以至于它保留了基因编码的荧光层的内源性荧光，如GFP和ISH。这是相当有利的。这就少了一个需要进行的孵化过程它允许你对其他目标进行免疫组化也可以对感兴趣的基因进行高空间分辨率的原位杂交。我相信在不久的将来你们会看到更多关于这类固定试剂的研究，我认为这是很有前途的。

最后，作为一个重要的信息，我想回顾一下这三个注意事项，一张好的图像总是从足够的采样和固定开始。你必须一直优化你的抗体条件因为固定变化，你的物种可能与抗体最初产生的物种不同你必须针对特定的条件进行优化，你的样本维度可能与抗体检测目标的方式相互作用。样品的后期处理是由样品大小和口头显微镜决定的。所以你也要记住为了获得最好的成像效果，你必须有最充分的阻碍介质。

最后，我想说的是，我总是对我的学生有这样的口头禅，最好是重复一个实验，而不是使用图像处理来达到你需要的质量结果。