钙成像是如何工作的?|钙指标和实验注意事项

钙(Ca2+)是一种重要的离子，在多种细胞功能中发挥作用。作为一种小离子，它可以在细胞质和细胞隔室中自由而迅速地移动。Ca2+可以作为从肌肉细胞(肌细胞)到神经元和许多其他细胞活性的快速指示器。这一领域的工作可以追溯到20世纪70年代Roger Tsien及其合作者关于EGTA Ca2+螯合特性的开创性工作。从那以后，钙指标(Ca2+指标)的发展继续为细胞生物学的基本原理提供了重要的见解，例如，细胞如何在不同的疾病状态下反应，或对治疗药物的反应。在这篇文章中，我们将看看已经开发的不同的荧光指标，以监测钙信号，局部钙水平和它们的通量或细胞和间隔空间动态的研究。

单波长钙测量

使用最方便和最快的Ca2+指示剂是单波长染料。这些通常用于指示活度，它们往往更有利于共焦成像，因为它们经常匹配共同的激发和发射波长和光源。

Fluo-4

在单波长Ca2+指示器中，Fluo-4是使用最广泛的。氟-4有机染料的吸收峰在490 nm左右，发射峰在520 nm左右，使其几乎理想的488激发和525发射-见下图。

图2:Fluo-4钙离子指示染料的吸收和发射分布图。

Fluo-4相对明亮和稳定，因此可以在较短的曝光时间内获得强信号，并且具有最小的光毒性，因为它也不需要可能产生更多活性氧的紫外线波长。Fluo-4是一种低亲和力Ca2+指示器，这意味着它允许在饱和前测量高Ca2+浓度，但不能很好地测量低Ca2+浓度，如休息细胞。在单波长测量中，通常使用F(t)/F(0)比率比较活性时的荧光发射与静息状态时的荧光发射。Ca2+浓度的定性测量可以通过这种方式实现，但这对定量测量提出了限制，因为定量测量需要数据规范化，以解释实验内部和跨实验的变化。潜在的问题包括细胞的染料负载不均，光漂白和染料从细胞泄漏在研究中。

Rhod染料

另一组单波长Ca^2＋指示剂是罗德染料。尽管应用不广泛，但它们将激发和发射向较长的波长转移，因此值得注意。例如，X-rhod-1在580 nm处激发，在600 nm处发射。这种向红色方向移动波长的原理有助于减少光毒性、自身荧光和组织内光散射的影响^2＋红色区域的指标继续扩大。在较长的波长工作的另一个好处是允许与其他荧光蛋白标记复用，或者可能促进利用通道视紫红质对膜电位的光遗传学控制(Lock等人，2015年)。

细胞内钙的比例染料- Fura-2, Indo-1

比率染料对定量工作很有用，因为它们修正了成像条件和标本制备的许多变化，如染料浓度或光漂白效果的变化。这允许在不同的实验之间校准和规范化数据。钙离子比率指标显示其发射光谱或吸收光谱的变化作为局部钙离子浓度的函数。这些染料的乙酰氧甲基(AM)酯化形式是首选的，因为它们扩散穿过细胞膜，并被细胞内酯酶切割，使细胞加载过程更容易和有效。

Fura-2

所有的Ca的比值^2＋其中Fura-2最为人所知。Fura-2在340nm和380nm处表现为钙的微分吸收^2＋(见下图)。这种变化的检测是通过510 nm附近的相对发射强度来揭示的。

图3:Fura-2 Ca2+指示染料在不同浓度的游离Ca2+中的激发。改编自荧光探针和研究化学品分子探针手册

因此，Fura-2的成像协议比单波长Ca更复杂^2＋指示灯和它需要光源提供照明在340和380纳米。Fura-2成像需要340 nm和380 nm的连续照明，在510 nm处检测，然后计算对发射图像的像素比。通过对自由离子浓度的校准，可以进一步分析图像。Fura-2对钙具有较高的亲和力^2＋使它非常适合于精确的定量测量在Ca^2＋但高浓度(通常超过1 μM)则不行。然而，有一些Fura-2染料开发的低亲和力允许在较高的Ca测量^2＋浓度。

Indo-1

另一种著名的比率染料是Indo-1，但在这种情况下，染料的发射效率在405 nm和485 nm的两个峰附近发生变化。Indo-1在340 nm左右被激发，可以用以405 nm和485 nm发射峰为中心的滤波器进行序列成像。

图4:Indo-1 Ca2+指示染料在不同浓度的游离Ca中的激发^2＋．改编自荧光探针和研究化学品分子探针手册

与Fura-2一样，图像是按像素比例排列的，可以根据游离Ca进行校准^2＋浓度。Indo-1的一个潜在问题是，在某些实验条件下，它可能相对不稳定。它常用于流式细胞术测量中，这不是一个问题。

基因编码钙指标(GECI)

另一类钙^2＋指标是基因编码钙指标(GECI)。GECI Ca^2＋GCaMP (Nakai等人，2001年)等指标是从绿色荧光蛋白(GFP)变体中推导出来的。GECIs允许在体内进行钙研究，现在广泛应用于转基因动物模型。通过使用GECIs，可以在单细胞水平上研究复杂的神经网络，也可以研究组织中特定细胞类型之间更广泛的空间关系，这是用电生理测量方法无法实现的。

Cameleon GECI依赖FRET信号来监测局部Ca^2＋通过改变供体和受体在结合Ca时的释放平衡来提高钙的浓度^2＋．cameleon直接将两种荧光蛋白与钙调素和M13肽结合，产生这对传感器。关于结合Ca^2＋，构象改变并增加了这些蛋白质之间的FRET耦合，改变了发射波长比。

GCaMP-X为钙监测应用提供了一系列的geci万博电脑网页版登录https://www.janelia.org/open-science/gcamp．正在进行的广泛的GCaMP衍生物的开发使它们更适合于现在的研究，包括为钙的多路复用开辟道路的彩色GECIs^2＋成像实验，允许更好地理解神经科学和其他领域所面临的一些复杂问题。

表1:常见Ca的例子^2＋所示指标-注意各种衍生物可包括高和低亲和形式，以适应不同的实验。K_d值是缓冲液中的值——值最终取决于温度、离子强度、pH值和其他随每次实验而变化的因素。

Ca^2＋结合特异性，亲和力和结合率

Ca的特异性^2＋钙的指示是需要考虑的，因为其他二价阳离子，如镁或锌，可能会干扰测量。卡得多紧、多快^2＋指标绑定到Ca^2＋离子也是钙成像研究的重要方面。结合亲和力定义为Ca的浓度^2＋其中一半的Ca^2＋指示分子与钙结合^2＋在平衡时，并表示为摩尔值(纳米到毫摩尔)，因此值低表示亲和性高。测量Ca应选择指标^2＋浓度在0.1到10倍之间_d裴瑞兹(et al .,2008)。选择这个范围是为了避免边界Ca和自由Ca的显著变化^2＋在牢房里。一般来说，高亲和力钙^2＋指标可用于研究钙的低水平^2＋而低亲和力的钙^2＋指标可用于研究较高浓度的钙^2＋通常在亚细胞间隔中发现。有多快^2＋指标结合和解结合对于一些动力学研究也很重要。这可以用关联常数K来描述_一个．K_一个它本身由两个分量描述:关联速率常数k_在除以解离速率常数k_从．还要注意K_一个1 / K_d．

实验注意事项

在比例染料所需的短波波长下工作在光学上具有挑战性。在本节中，我们将讨论一些关键的考虑因素:

钙成像的推荐光源

图5:冷却的pE-340^fura从pE-300系列发展而来，专门为Ca^2＋图像(图片由Chris Deeks提供，cool)。

虽然普通光源广泛适用于单波长研究，但比率研究通常不是这样。水银灯表现出相当峰值的强度轮廓，使他们不适合比率成像。相比之下，氙灯在可见光谱上有一个相对平坦的强度，但在最流行的比例染料激发的紫外光处强度会下降。此外，弧光灯的寿命往往很短，只有几百小时左右，而且含有需要处理的有害物质，但随着led在过去10-15年的发展，弧光灯现在实际上已经过时了。我们可以利用led来生产钙^2＋成像提供高强度照明和固态可靠性，寿命和切换速度。

特别是,很酷的pe - 340^fura可同时满足单波长和比波长染料的照明要求:

• 专用340 nm和380 nm led用于Fura-2和Indo-1比值钙成像
• 用于Fluo-4或GCaMP6等GECIs的宽白色输出(435 nm - 645 nm)
• 通过TTL实现单个通道的微秒切换，以捕获高速事件
• 稳定的LED照明将噪音降至最低
• 从一个TTL-out序列激励
• 兼容大多数成像软件集成控制与成像设置
• 典型寿命为20000小时

适用于钙成像的探测器

为了最准确地测定细胞生理学，应使用最低的光照强度和最低浓度的指示染料。这必然导致低光子发射，这意味着一个灵敏的探测器是非常重要的。有两种主要的照相机技术用于照相机^2＋成像实验- sCMOS和EMCCD。这些的选择，比如Ca^2＋鉴于应用范围广泛，指标将取决于研究本身。万博电脑网页版登录

一般来说，sCMOS相机的性能显著Andor zla sCMOS摄像机已经被广泛应用于Ca^2＋成像实验。这些相机非常适合大多数实验:

• 最佳信噪比-高灵敏度高达82%和1e噪声
• 高时间分辨率-可达100hz的全帧，小视场的> 1khz
• 宽视野-高达21.8毫米(Zyla 5.5)
• 高分辨率- 6.5µm像素适合流行的60倍和40倍
• 全局快门选项-用于跨视场的时间精度至关重要

因此，Zyla sCMOS相机仍然是Ca的推荐产品^2＋成像。阅读更多关于神经生物学成像的探测器解决方案．

最近，新一代背光sCMOS相机出现了，这些现在为以前的基准Zyla sCMOS相机提供了一个替代方案^2＋成像。新Sona背光系列在Zyla模型的性能基础上，保持了重要的高速、高分辨率和一流的定量精度(对比率成像至关重要)，并添加:

• 更高的灵敏度- 95%量化宽松提高灵敏度和扩展响应跨更广泛的光谱-用于UV和红外区域的多重成像和染料
• 更高的视野-高达32毫米(Sona 4.2B-11)
• 更高的动态范围可达53,000:1
• 永久真空技术的最高寿命
• 深度冷却低至-45°C，传感器响应均匀，插值滤波较少

尽管sCMOS的广泛适用性和它们的持续发展，EMCCD探测器技术继续保持高度相关。通过利用电子乘法，iXon EMCCD相机s是单光子敏感的，因此工作在光子水平低于任何当前基于sCMOS的相机的检测极限。一些光饥饿钙的例子^2＋适合高灵敏度iXon EMCCD相机的成像实验有:

• 快Ca^2＋低光子通量成像-可能需要EMCCD的额外灵敏度，因为在非常短的曝光期间捕获的低信号水平
• GECIs研究——越来越多的研究使用这些表达的Ca^2＋指示剂通常涉及非常弱的发射水平- iXon EMCCD经常被发现是首选的探测器选项

了解更多关于Ca的EMCCD相机^2＋成像看到心脏Ca检测仪解^2＋研究

相关的出版物

• 张晓燕，张晓燕，钱永华(1985)。“新一代的Ca^2＋具有大大改进的荧光特性的指示器”。生物。化学学报。260(6):3440-50。PMID 3838314
• 锁定JT，帕克I，史密斯IF。Ca²⁺荧光指示剂对培养细胞中局部Ca²⁺信号显像的比较细胞钙。2015;58(6):638-648。doi: 10.1016 / j.ceca.2015.10.003
• 细胞内钙^2＋Indo-1在附底物细胞中的测量:优点和特殊考虑。细胞钙。1990年8月11(7):487-500。0143 - 4160 . doi: 10.1016 /(90) 90081 - 5。PMID: 2272082。
• 中井俊，大仓美，岩本幸(2001年2月)。高信噪比Ca (^2＋)由单一绿色荧光蛋白组成的探针"。自然生物技术，19(2):137-41。doi: 10.1038/84397。PMID 11175727。S2CID 30254550。
• 裴瑞德，艾茨勒，瓦茨，魏政，莱希莱特(2008)。化学钙指标。46:3, 143-151页。ISSN 1046 - 2023。https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2008.09.025．